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植物细胞的大规模悬浮培养

      目前用于植物细胞大规模培养的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植物细胞或原生质体的固定化培养。 
  植物细胞的大规模悬浮培养通常采用水平振荡摇床,该摇床可变转速为30~150 r/min,振幅2~4 cm,温度24~30 ℃。适合于愈伤组织培养的培养基不一定适合悬浮细胞培养。悬浮培养的关键就是要寻找适合于悬浮培养物快速生长、有利于细胞分散和保持分化再生能力的培养基。 
  ⒈ 悬浮培养中的植物细胞的特性 

  由于植物细胞有其自身的特性,尽管人们已经在各种微生物反应器中成功进行了植物细胞的培养,但是植物细胞培养过程的操作条件和微生物培养的是不同的。与微生物细胞相比,植物细胞要大得多,其平均直径要比微生物细胞大30~100倍。同时植物细胞很少是以单一细胞形式悬浮存在,而通常是以细胞数在2~200之间,直径为2 mm左右的非均相集合细胞团的方式存在。根据细胞系来源、培养基和培养时间的不同,这种细胞团通常由以下几种方式存在:① 在细胞分裂后没有进行细胞分离;② 在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时,开始分泌多糖和蛋白质,黏合成细胞团;③ 以其他方式形成黏性表面,从而形成细胞团。当细胞密度高、黏性大时,容易产生混合和循环不良等问题。

   由于植物细胞的生长速度慢,操作周期就很长,即使间歇操作也要2~3周,半连续或连续操作更是可长达2~3个月。同时由于植物细胞培养基的营养成分丰富而复杂,很适合于真菌的生长。因此,在植物细胞培养过程中,保持无菌是相当重要的。 

       2、悬浮细胞的生长与增殖 
  由于悬浮培养具有三个基本优点:① 增加培养细胞与培养液的接触面,改善营养供应;② 可带走培养物产生的有害代谢产物,避免有害代谢产物局部浓度过高等问题;③ 保证氧的充分供给。因此,悬浮培养细胞的生长条件比固体培养有很大的改善。 

图1 悬浮培养时细胞的生长曲线
  悬浮培养时细胞的生长曲线如图1所示,细胞数量随时间变化曲线呈现S形。在细胞接种到培养基中最初的时间内细胞很少分裂,经历一个延滞期后进入对数生长期和细胞迅速增殖的直线生长期,接着是细胞增殖减慢的减慢期和停止生长的静止期。整个周期经历时间的长短因植物种类和起始培养细胞密度的不同而不同。在植物细胞培养过程中,一般在静止期或静止期前后进行继代培养,具体时间可根据静止期细胞活力的变化而定。 
  3、细胞团和愈伤组织的再形成和植株的再生 
  悬浮培养的单个细胞在3~5 d内即可见细胞分裂,经过一星期左右的培养,单个细胞和小的聚集体不断分裂而形成肉眼可见的小细胞团。大约培养两周后,将细胞分裂再形成的小愈伤组织团块及时转移到分化培养基上,连续光照,三星期后可分化成试管苗。 

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