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发酵过程中初级代谢的代谢变化

  前已述及微生物发酵有三种方式即分批发酵(batchfermentation)、补料分批发酵(fed-batchfermentation)和连续发酵(continuousfermentation)。工业上为了防止出现菌种衰退和杂菌污染等实际问题,大都采用分批发酵或补料分批发酵这两种方式。其中补料分批发酵已被广泛采用,因为它的技术介于分批发酵和连续发酵之间,兼有两者的优点,又克服了它们的缺点。各种不同发酵方式菌体代谢变化也不相同,但为了了解其基本变化,仍以分批发酵为基础来说明其代谢规律。

   微生物的分批发酵过程,因其代谢产物的种类不同而有一定的差异,但大体上是相同的。产生菌体经过一定时间不同级数的种子培养,达到一定菌体量后,移种到发酵罐进行纯种和通气搅拌发酵(发酵工业中,绝大部分是好氧发酵),到规定时间即结束。

  如在霉菌、放线菌的发酵过程中,随着菌体的生长和繁殖,培养液的物理性质、菌体形态和生理状态都可能会发生显著的变化,如:培养液的表观黏度可能增大,液体的流变学特性改变,进而影响罐内的氧传递、热传递和液体混合等过程。细胞在初期和后期的生理活性也不相同。因此,了解各种不同菌体在发酵过程中的生长曲线及代谢变化,有利于对发酵过程进行控制。

   从产物形成来说,代谢变化就是反映发酵中的菌体生长、发酵参数的变化(培养基和培养条件)和产物生成速率这三者之间的关系。按照菌体生长、碳源的利用、产物的生成速率的变化以及这三者之间的动力学关系来考虑,Gaden把微生物发酵过程分为三种类型(参见第五章)。微生物的代谢产物,按其与菌体生长、繁殖的关系来说,又分为初级代谢产物(primarymetabolite)和次级代谢产物(secondarymetabolite)。对微生物酶、药物来说,这两类产物都有,特别是抗生素这类次级代谢产物在微生物药物中占有最大的比重。
   初级代谢的代谢变化
  初级代谢是生物细胞在生命活动过程中所进行的代谢活动,其产物即为初级代谢产物。发酵中的菌体、基质和产物三者变化的基本过程是:菌体进入发酵罐后就开始生长、繁殖,直至一定的菌体浓度。其生长过程仍显示停滞期、对数期、稳定期和衰亡期等生长史的特征。但在发酵过程中,即使同一菌种,由于菌体的生理状态与培养条件的不同,各个时期时间长短也不尽相同。如停滞期的长短就随培养条件而有所不同,并与接种菌的生理状态有关。对数期的菌种移植到与原培养基组成完全相同的新培养基中,就不会出现停滞期,仍以对数期的方式继续繁殖下去。另外,用稳定期以后的菌体接种,即使接种的菌体全部能够生长,也要出现停滞期。因此,工业发酵中往往要接入处于对数期(特别是中期)的菌体,以尽量缩短停滞期。为了获得代谢产物,菌体尚未达到衰亡期即行放罐处理。随着菌体生长繁殖和产物的形成,基质(如葡萄糖)浓度的变化一般是随发酵时间的延长而不断下降,溶解氧浓度也随发酵过程变化而发生变化。初级代谢产物由于没有明显的生产期,所以它是随菌体生长在不断地生成的,有的与菌体生长成平行关系,如乳酸、醋酸、氨基酸和核酸等。
图1 谷氨酸发酵的代谢曲线
  图1表示初级代谢产物谷氨酸发酵过程的代谢变化。变化的根本原因在于菌体的代谢活动引起环境的变化,而环境的变化又反过来影响菌体的代谢。在发酵初期种子刚接入发酵罐中,菌体处于停滞期,以适应新的环境。细胞进行呼吸作用,利用贮存物质合成大分子物质和所需的能量,菌体个体长大,但没有分裂,此时糖等基质基本不消耗或很少消耗,pH值稍有上升是尿素被分解放出氨所致。菌体经过停滞期之后就开始繁殖,并很快进入对数期,代谢逐渐旺盛,菌体大量繁殖,个体生长和群体繁殖循环交替进行,培养物的混浊度(以光密度表示)与菌体增殖情况基本一致,OD值(光密度)直线增长,菌体形态与二级种子相同,绝大多数为“V”形分裂。耗糖速度加快,糖作为碳源和能源用于合成细胞成分和合成反应所需要的能量。尿素被脲酶分解放出氨使pH值上升,氨被菌体利用可使pH值下降,这时需及时补加尿素,补充氮源和调节pH值。由于菌体代谢活动放出热,温度开始上升,一般发酵5h左右温度上升,应注意降温。由于菌体不断增加,代谢旺盛,产生CO2,排气中CO2浓度显著增加。耗氧量很快增加,培养基中的溶解氧下降,排气中的O2浓度也下降,应根据情况提高风量,特别是在对数期的末期,应注意风量,促进菌体转化。此时为长菌阶段,极少产谷氨酸,控制发酵条件以有利于长菌。但在对数期的末期要加大风量,供给充足的氧,并及时流加尿素,供给充分的氮源,促进增殖型菌体向生产型菌体转化。在生物素限量的情况下,部分菌体内的生物素含量由“丰富转向贫乏”,此部分菌就停止繁殖,在条件适宜时,开始伸长、膨胀,形成生产型细胞,开始积累谷氨酸。但是由于菌体增殖并非完全同步,还有部分菌体为增殖型,这是菌体由增殖型向生产型转化的时期,约需10~18h。在此期间,菌体数量达到最大值,培养液的OD值与菌体增殖不一致,OD值除反映菌体增殖外,还反映了菌体的伸长、膨胀。这是代谢最旺盛的时期,耗糖加快,谷氨酸生成迅速增加,耗氧速率加快,并接近最大值。发酵控制方面必须充分供氧,风量达最大值,充分供给氮源。对发酵控制来讲,此时以前的控制是发酵成败的关键。此时期的变化受生物素和风量的明显影响。一般来说,加大风量对菌体的伸长、膨胀有促进作用。菌体完成由增殖型向生产型转化后,菌形几乎都伸长、膨胀、边缘不整齐、像花生型。大量积累谷氨酸,耗糖与产酸相适应,产酸达最大值,对糖的转化率达50%~56%,应继续流加尿素,保证充足的氮源,pH值维持7.0~7.2。为加快产酸速度,应适当提高温度,一般为36~37℃。根据菌体耗氧速率继续供氧,随着发酵的延长,糖已耗尽,产酸增加,菌体活力逐渐降低。发酵后期耗氧减少,可适当降低风量。流加尿素以少量为好,控制pH值6.8~7.0。当残糖降到1%,根据发酵情况可将风量降到最低,促进中间产物转向谷氨酸。
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