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分批发酵动力学

       分批发酵是指在一个密闭系统内投入有限数量的营养物质后,接入少量的微生物菌种进行培养,使微生物生长繁殖,在特定的条件下只完成一个生长周期的微生物培养方法。该法在发酵开始时,将微生物菌种接入已灭菌的培养基中,在微生物最适宜的培养条件下进行培养,在整个培养过程中,除氧气的供给、发酵尾气的排出、消泡剂的添加和控制pH值需加入酸或碱外,整个培养系统与外界没有其他物质的交换。分批培养过程中随着培养基中的营养物质的不断减少,微生物生长的环境条件也随之不断变化,因此,微生物分批发酵是一种非稳态的培养方法。 
  在分批发酵过程中,随着微生物生长和繁殖,细胞量、底物、代谢产物的浓度等均不断发生变化。微生物的生长可分为停滞期、对数期、稳定期和衰亡期四个阶段,图1为典型的细菌生长曲线。表1为细菌细胞在分批发酵过程中各个生长阶段的细胞特征。 

图1 分批发酵过程中典型的细菌生长曲线 

表1 细菌在分批发酵过程中的各个生长阶段的细胞特征 

处于不同生长阶段的细胞成分也有很大的差异。图2为不同生长阶段细胞成分的变化曲线。 

图2 不同生长阶段细胞成分的变化曲线 

  ⑴ 停滞期 停滞期是微生物细胞适应新环境的过程。此时,微生物细胞从一个培养基被转移至另外一个培养基中,细胞需要有一个适应过程,在该过程中,系统的微生物细胞数量并没有增加,处于一个相对的停止生长的状态。但细胞内却在诱导产生新的营养物质运输系统,可能有一些基本的辅助因子会扩散到细胞外,同时参与初级代谢的酶类再调节状态以适应新的环境。 
  实际上,接种物的生理状态和浓度是停滞期长短的关键。如果接种物处于对数期,那么就很有可能不存在停滞期,微生物细胞立即开始生长。反过来,如果接种物本身已经停止生长,那么微生物细胞就需要有更长的停滞期,以适应新的环境。 
  ⑵ 对数期 处于对数期的微生物细胞的生长速率大大加快,单位时间内细胞的数目或质量的增加维持恒定,并达到最大值。如在半对数纸上用细胞数目或质量的对数值对培养时间作图,将可得到一条直线,该直线的斜率就等于μ。 

如果当t=0时,细胞的浓度为c0(X),上式积分后就为: 

  微生物的生长有时也可用“倍增时间”(td)表示,定义为微生物细胞浓度增加一倍所需要的时间,即 

  微生物细胞比生长速率和倍增时间因受遗传特性及生长条件的控制,有很大的差异。表2列出了几种不同的微生物受培养基和碳源综合影响时的比生长速率和倍增时间。应该指出的是,并不是所有微生物的生长速度都符合上述方程。如当用碳氢化合物作为微生物的营养物质时,营养物质从油滴表面扩散的速度会引起对生长的限制,使生长速率不符合对数规律。某些丝状微生物的生长方式是顶端生长,营养物质在细胞内的扩散限制也使其生长曲线偏离上述规律。 
表2 微生物的比生长速率和倍增时间

微 生 物

碳  源

比生长速率/h-

倍增时间/min

大肠杆菌

 

中型假丝酵母

 

地衣芽孢杆菌

复合物 
葡萄糖+无机盐 
醋酸+无机盐 
琥珀酸+无机盐 
葡萄糖+维生素+无机盐 
葡萄糖+无机盐 
C6H14+维生素+无机盐 
葡萄糖+水解酪蛋白 
葡萄糖+无机盐 
谷氨酸+无机盐

1.2
2.82
3.52
0.14
0.35
1.23
0.13
1.2
0.69
0.35

35
15
12
300
120
34
320
35
60
120

  ⑶ 稳定期 在微生物的培养过程中,随着培养基中的营养物质的消耗和代谢产物的积累或释放,微生物的生长速率也就随之下降,直至停止生长。当所有微生物细胞分裂或细胞增加的速率与死亡的速率相当时,微生物的数量就达到平衡,微生物的生长也就进入了稳定期。在微生物生长的稳定期,细胞的质量基本维持稳定,但活细胞的数量可能下降。 
由于细胞的自溶作用,一些新的营养物质,诸如细胞内的一些糖类、蛋白质等被释放出来,又作为细胞的营养物质,从而使存活的细胞继续缓慢地生长,出现通常所称的二次或隐性生长。 
  ⑷ 衰亡期 当发酵过程处于衰亡期时,微生物细胞内所储存的能量已经基本耗尽,细胞开始在自身所含的酶的作用下自溶死亡。 
需要注意的是,微生物细胞生长的停滞期、对数期、稳定期和衰亡期的时间长短取决于微生物的种类和所用的培养基。 
  ⒉ 微生物分批发酵的生长动力学方程 
  分批发酵过程中,虽然培养基中的营养物质随时间的变化而变化,但通常在特定条件下,其比生长速率往往是恒定的。1942年,Monod提出了在特定温度、pH值、营养物类型、营养物浓度等条件下,微生物细胞的比生长速率与限制性营养物的浓度之间存在如下的关系式(Monod方程): 

式中 μm——微生物的最大比生长速率,h-1; 
c(S)——限制性营养物质(底物)的浓度,g/L; 
Ks——饱和常数,g/L。 
  Ks的物理意义为当比生长速率为最大比生长速率一半时的限制性营养物质浓度,它的大小表示了微生物对营养物质的吸收亲和力大小。Ks越大,表示微生物对营养物质的吸收亲和力越小;反之就越大。对于许多微生物来说,Ks值是很小的,一般为0.1~120 mg/L或0.01~3.0 mmol/L,这表示微生物对营养物质有较高的吸收亲和力。一些微生物的Ks值见表3。 
表3 一些微生物的Ks值 

  微生物生长的最大比生长速率μm在工业生产上有很大的意义,μm随微生物的种类和培养条件的不同而不同,通常为0.09~0.65 h-1。一般来说,细菌的μm大于真菌。而就同一细菌而言,培养温度升高,μm增大;营养物质的改变,μm也要发生变化。通常容易被微生物利用的营养物质,其μm较大;随着营养物质碳链的逐渐加长,μm则逐渐变小。 
 
图3 微生物比生长速率与底物浓度之间的关系 
  微生物比生长速率μ与底物浓度c(S)之间有一定的关系,如图3所示。图中线段a表示营养物质浓度很低,即c(S)<<Ks时,微生物的比生长速率与营养物质浓度的关系为线性关系,此时Monod方程可写为;线段b为适合Monod方程段;线段c表示营养物质浓度很高,即c(S)>>Ks时,微生物的比生长速率与营养物质浓度的关系。正常情况下,μ≈μm,但这也正是由于营养物质或代谢产物导致抑制作用的区域,目前尚没有相应的理论方程描述此区域的情况,但有时可按下式表达: 

式中 KI——抑制常数。 
  因此,实践上为了避免发生营养物质的抑制作用,分批发酵不应在高营养物质浓度下开始进行。 
  除Monod方程外,还有其他一些类似的微生物生长动力学方程式,但在大多数情况下,实验数据与Monod方程较为接近,因此Monod方程的应用也更为广泛。

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